编译：张蕾审校：贾友超来源：肿瘤资讯
血液和淋巴系统恶性肿瘤是首批被NGS测序的癌症类型之一，可能是因为它们更容易获得。基于这些研究，具有诊断、预后和/或预测影响的临床相关基因畸变的数量迅速增加，这增加了对分子诊断的需求，以确保在诊断环境和合理的时间范围内，检测到不同类型的基因改变。
对于恶性血液病，遗传学自几十年来一直是诊断的重要组成部分，包括细胞遗传学、荧光原位杂交(FISH)和靶向突变分析和/或Sanger测序等方法。靶向基因面板已经被添加到诊断实验室的方法库中。无论诊断测试的类型是什么，必须根据国际标准和准则统一方法。为了确保可比较的结果，特别是在多中心研究中，结果的解释和临床报告必须遵循既定的指南。这一点尤其重要，因为不同的NGS检测涵盖了一系列不同的遗传变异，基因检测结果变得更加复杂。
本文综述了目前应用于淋巴细胞恶性肿瘤临床诊断的各种分子技术及其优缺点，还对需要考虑的方面进行了探讨，以协调临床解释和报告的NGS数据。
贾友超
医院肿瘤内科副主任博士，主任医师，硕士生导师
专注恶性淋巴瘤诊治及基础研究
张蕾
医院肿瘤内科
淋巴系统恶性肿瘤的诊断技术
分子细胞遗传学
长期以来，细胞遗传学或染色体显带分析一直用于定义不同淋巴细胞恶性肿瘤中观察到的复发性染色体畸变。虽然细胞遗传学在白血病(即急性髓系白血病[AML]，急性淋巴母细胞白血病[ALL]和慢性髓系白血病)中仍然处于中心地位，但分子细胞遗传学或FISH是成熟淋巴类恶性肿瘤的首选。FISH技术的引入不仅可以对中期染色体进行分析，也可以对间期染色体(即未分裂的细胞)进行分析。因此，FISH比细胞遗传学更快，可用于筛查复发诊断或风险分层基因组畸变。此外，FISH可以应用于各种组织类型，如血液涂片、印迹以及福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)组织。FISH探针可用于大多数经常性的畸变，通常用于检测淋巴瘤的易位；例如，套细胞淋巴瘤中的t(11;14)和弥漫大B细胞淋巴瘤中的MYC和BCL2易位。在慢性淋巴细胞白血病(CLL)中，一组探针通常用于检测风险分层异常，即11q缺失、13q缺失、17p缺失和12三体，而在多发性骨髓瘤中，探针用于识别t(4;14)、t(11;14)、t(14;16)、1q增益和17p缺失。然而，虽然间期细胞上的FISH可以快速回答是否存在特定的遗传畸变，但这并不是一种特别敏感的技术；检测畸变的cutoff值必须由每个实验室确定，通常在5%左右。
有针对性的突变分析
在NGS时代之前，大多数临床实验室采用Sanger测序进行靶向突变分析。上世纪80年代以来，Sanger测序一直是金标准，但如果研究多个基因或大量基因，就显得昂贵和费时。另一个缺点是它的灵敏度通常在10%~20%。
在CLL中，TP53突变与化疗免疫治疗的差应答率和总生存率低有关，而TP53基因筛查现在是任何方案开始前的必须性筛查。TP53基因分析(包括外显子2-11)通常是通过Sanger测序来完成的，尽管最近许多实验室开始使用NGS。
另一种基于测序的分子检测是IGHV基因突变状态，这决定了未突变IGHV基因的CLL预后较差，而突变IGHV基因的CLL预后较好。该分析主要是通过聚合酶链反应(PCR)扩增克隆IGH重排，然后进行Sanger测序，尽管新的NGS方案已经开发。
对于TP53和IGHV基因分析，欧洲CLL研究倡议(ERIC)提供了技术建议和指导。它还实施了专门的认证系统，使临床实验室能够根据标准操作程序定期认证他们的方法(Sanger测序或NGS)。
对于热点突变的检测已经建立了特异的检测方法，如毛细胞白血病的BRAF(VE)和Waldenstr?m巨球蛋白血症的MYD88突变(LP)。这些使用等位基因特异性PCR或定量PCR检测突变等位基因。最近，数字微滴PCR技术已经被开发出来，能够进行非常敏感的检测(降低到0.01%)，可以用于检测复发突变或跟踪患者一段时间。例如，它用于检测接受伊布替尼治疗的CLL患者的BTK/PLCG2突变。
NGS
利用该技术，我们可以分析整个基因组(全基因组测序[WGS])、外显子组(全外显子组测序)或特定的区域，即靶向的NGS或基因面板。根据测序的具体情况，获得的序列读取数是不同的。使用WGS，对肿瘤样本的推荐序列深度为90(对匹配的正常样本为30)。对于目标基因面板，根据面板的大小，目标是至少个高序列深度，但最好超过个。
基于扩增子的技术的局限性是潜在的扩增偏差，特别是在测序困难的区域(即GC丰富和/或重复区域)，可能导致扩增子的丢失，以及增加低频率、假阳性突变的风险；当FFPE材料用作输入来源时，这种情况会发生。
为了研究基于扩增子的基因板的稳健性，我们在ERIC内部最近进行了一项多中心研究，使用三种不同的技术(Multipli
