引言
结直肠癌（CRC）是全球导致癌症相关死亡的第二大原因。CRC患者的5年生存率与诊断分期息息相关。CRC早期诊断患者的5年生存率高于80%，CRC晚期诊断患者的5年生存率低于10%。大量研究表明，患者血清中特定CRC自身抗原[肿瘤相关抗原（TAA）]对应的自身抗体有助于早期诊断。因此，本研究旨在识别CRC特异性自身抗体的自身抗原靶点，借助液体活检技术有效筛查CRC患者和健康个体。为此，西班牙CarlosIIIHealthInstitute的RodrigoBarderas等研究人员从CRC患者体内提取5个CRC细胞系和组织样本，通过免疫沉淀-质谱分析法测量其分泌的外泌体的蛋白质含量，共鉴定出种蛋白质为潜在的CRC特异性自身抗原。采用生物信息学技术和荟萃分析，他们选定了15种与实际CRC自身抗原类似度更高的蛋白质，以便后续借助蛋白质印迹法（WB）和免疫组织化学技术（IHC）评估它们在CRC预后中的作用。结果发现，在患者的组织和血浆外泌体样本中，有11种蛋白质发生蛋白质水平失调，有9种蛋白质与CRC预后有关。经验证发现，除一例外，所有研究均显示出具有统计学意义的高诊断能力，采用荧光Halotag磁珠，或者借助多路生物传感平台（磁性微载体为固相载体，由用于CRC细胞检测的共价固定Halotag融合蛋白修饰），能够有效筛查区分CRC患者、癌前病变个体与健康个体。综上所述，本文的研究结果突出了此研究方法在识别慢性疾病特征TAA时的有效性；此外，本文采用的测量血浆中TAA对应的自身抗体水平的方法可以应用到具有高诊断能力的CRC检测即时医疗（POC）设备中。
近年来，多种蛋白质组学技术被用于鉴定TAA，重点是微阵列的应用，如噬菌体或天然重组蛋白微阵列。然而，这些技术受到同时分析的样本数量或打印在阵列上的蛋白质数量的限制。蛋白质阵列只包括人类所有蛋白质的50%~66%，不包括翻译后修饰或蛋白质组。最近，西班牙CarlosIIIHealthInstitute的RodrigoBarderas等研究人员开发了一种新的方法来解决这些问题，即使用从CRC细胞中提取的蛋白质鉴定TAA。该方法包括免疫沉淀和液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）程序的组合，然后是血清反应性试验。
外泌体是细胞分泌的30~nm大小的细胞外囊泡。它们通过血管或淋巴管介导周围细胞之间以及与远端器官细胞之间的细胞信息传递。据报道，肿瘤源性外泌体（TDE）参与癌症发展和转移的各个环节，包括诱导上皮-间充质转化的激活，转移前生态位的形成，以及受体细胞免疫反应的调节。因TDE组成、功能及其在体液中的分布，TDE是一种可用于特异性识别CRC的令人感兴趣的、几乎未被探索的TAA来源。
肿瘤微环境（TME）由癌细胞、各种驻留和浸润的宿主细胞、分泌因子和细胞外基质蛋白组成。基质滋养癌细胞，促进肿瘤的生长、侵袭和转移。此外，TME有助于调控TAA表达和免疫细胞浸润。因此，对包含癌细胞和肿瘤基质的CRC肿瘤组织的分析，应该识别出在培养的癌细胞分析中遗漏的肿瘤间质新抗原。
在这项研究中，西班牙CarlosIIIHealthInstitute的RodrigoBarderas等研究人员分析了CRCTDE和TME作为识别可能有助于早期检测这种疾病的CRC特异性TAA的补充和稀有分析来源。对于TAA的鉴定，他们使用了最近描述的方法，该方法包括IP和LC-MS/MS的组合，使用外泌体和CRC肿瘤组织，然后进行血清反应性测定。用于TAA鉴定的外泌体，分别从SW和KM12CCRC细胞的分泌组中分离出来，作为原发性肿瘤的模型；从SW、KM12SM和KM12L4a细胞的分泌组中分离出来，作为CRC转移到淋巴结、肝脏、肝和肺的模型。实验使用从不同阶段患者的血浆样本中分离的CRC组织样本和外泌体用于验证疾病过程中TAA的失调。最后，他们将TAA集成到基于Halotag技术的电化学免疫传感平台中，以构建POC设备，用于区分CRC患者和携带癌前病变的个体以及健康个体。图1描述了这项研究的工作流程。
图1.本研究中使用的工作流程方法，用于识别、验证和整合来自CRC患者的外泌体和组织样本中TAA的POC诊断设备。使用IP结合质谱法研究了来自五种具有不同转移能力的CRC细胞系分泌的外泌体的蛋白质提取物，和来自I~IV期CRC患者的组织样本，以鉴定在疾病过程中失调的CRC特异性潜在TAA。本研究对来自CRC患者鉴定出IgG具有特异性血清反应性的种蛋白质进行了荟萃分析，并确定了15种蛋白质更有可能被实际用于验证TAA。WB、IHC和荟萃分析被用于确定它们与CRC发展、进展和预后的关联。最后，在将蛋白质整合到类似的POC设备上以诊断CRC和结肠直肠癌前病变个体之前，通过血清反应性发光测定验证了这些蛋白质的血清反应性。
虽然西班牙CarlosIIIHealthInstitute的RodrigoBarderas等研究人员通过比较CRC和癌前病变患者与健康人血浆，无偏地发现了自身抗体标志物，但这些生物标志物的诊断能力应该进一步通过使用大量的样本和独立的患者队列来验证。进一步的研究必定会通过复用本文描述的TAA和先前验证的CRCTTA来获得诊断平台。这种多路生物（传感）平台（如本文所述，集成了15个CRCTAA）对于基于血液的CRC临床诊断应该具有足够高的灵敏度、特异性和曲线下面积（AUC），从而显示出极大的提高患者存活率和降低卫生系统治疗CRC相关成本的潜力。
关键词：自身抗体;诊断;结直肠癌;外泌体;肿瘤微环境;体液免疫应答;即时医疗;生物传感器
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